Kultury, uzyskiwanie formy konidialnej

Hej,

Coraz częściej trafiam na gatunki, gdzie krytyczną i kluczową cechą jest postać konidialna. Kombinuję jak mogę metodami domowymi, trzymam owocniki w platikowych pudełeczkach w cieple, dbam, żeby nie zapleśniały..... i niekiedy się udaje uzyskać anamorfy a niekiedy nie: (

Obawiam się, że nadzedł czas, żeby jakoś to pozbierać do kupy i nauczyć się uzyskiwać anamorfy w szalkach, jak to się powinno robić.

W monografiach w dobrych działach Materials & Methods zazwyczaj są podane, jak autorzy uzyskują kultury, na przykład:

(Samuels & Rossman, Genera of Bionectriaceae, Hypocreaceae, and Nectriaceae (Hypocreales, Ascomycetes))

Moje pierwsze pytania sa podstawowe:

1. Czy ktoś z Was ma już jakieś doświadczenia w uzyskiwaniu czystych kultur?

2. Skąd brać pożywki, kto ma do nich dostęp?

O ile dobrze pamietam, to firma SIGMA ma wiele różnosci m. in. pożywki

sigmaaldrich.com

Z tego fragmentu wyżej wnioskuję, co będzie potrzebne:

- szalki (płytki) Petriego - do kupienia np. w sklepach internetowych (łatwo znaleźć)

- odczynniki, ewentualnie gotowe pożywki - jak wyżej

- woda destylowana - to już bardzo łatwo zdobyć

- sprzęt - pipety, ssawka do pipet (żeby nie pipetować ustami <rotfl>), jakieś szkło miarowe, rękawiczki lateksowe - wszystko da się kupić, ale to trochę kosztuje, szkło widziałem nawet na Allegro.

Nie wiem, co z tą lampą UV, to pewnie po to, żeby zabić bakcyle, ale z drugiej strony, to ja bym się bał o zdrowie grzybków... może lepiej jakiś antybiotyk dodać?

Odczynniki i pożywki można kupić na przykład tutaj:

sigmaaldrich.com

biocorp.pl

Takich firm jest oczywiście więcej.

Problem zasadniczy to sterylność takiej hodowli - w powietrzu latają nie tylko bakterie, ale też zarodniki i np. bardzo łatwo zakazić szalkę Aspergillus, czy Penicilium. U Ciebie tego cholerstwa będzie znacznie więcej. Trudno wymagać, żebyś przywalił w środku kuchni laminar - wtedy żona na 100% by Cię razem z nim wyniosła, a poza tym taka zabawka kosztuje. Proponuję takie rozwiązanie - ostrożnie zrobić jak najwiecej szalek z pożywką, tylko lekko uchylając górną część szalki przy wylewaniu agaru, przed i po przyświecić UV nad biurkiem - lampa jest tańsza niż sam laminar - a bakterie wybije. Jak już agar zastygnie (w lodówce, lepiej żeby szalki były razem zamknięte w jakimś pojemniku) i podloże będzie gotowe, to podobnie postąpić przy szczepieniu szalek - tylko lekko uchylić wieczko. Wtedy jest szansa, że żadne paskudztwo tam nie wpadnie (bo jeśli zdejmiemy całkiem wieczko i tak to sobie zostawimy, to mamy 99, 99% szans, że coś niechcianego tam wyrośnie;-)).

Możesz jeszcze zapytać Barala, co o tym sądzi.

Reszta potem:-)

co do techniki po domowemu to najlepiej zapytac kogos kto to robi "nie w laboratorium" - Baral lub inni koledzy

zakupy to najprosciej w centrali zaopatrzenia medycznego - na ulicy Widnej przy zakonczeniu ul. Slicznej we Wroclawiu

jest Cezal - tam idziesz do Pani w dziale handlowym i mówisz co potrzebujesz a ona z katalogu wybiera

maja tam szalki petriego, pozywki to kup gotowe a rozrobienia - to sa standardy, mozesz jeszcze kupic ezę, to taki srebrny drucik z pentelka wtopiony w szklanna bagietke

wsuwa sie go w plomien (zapalniczka ujdzie) to zabija cokolwiek na nim by bylo, potem pobiera sie nim probke materialu i rozprowadza po agarze

osobna historia to jak sterylizowac szalki z pozywka, fachowo robi sie to w sterylizatorze (takim +- jak u dentysty), mozna sie pobawic w piekarniku o ile masz w miarę nowoczesny gdzie mozna nastawić niską temp. <100C i ją w miarę precyzyjnie utrzymać

szczegóły sterylizacji - ile czasu w jakiej temperaturze - to trzeba by wyczytac w dowolnym podreczniku mikrobiologii - nie mam takiego pod ręką

osobna historia to nakladanie materiału tak aby nie zanieczysczyć, jedno to sprawa że czymś sterylizowanym w płomienniu, na chwilę przed pobraniem materiału - pisałem o tym wyżęj

drugie to aby nie zanieczyścić samej pożywki w szalce przy uchyleniu wieczka, myślę że będą zadawalające rezultaty bez specjalnych cudów, jedynie przy sprawnej akcji z niewielkim uchyleniem wieczka szalki

najlepiej to takie detale popytaj tych którzy to robią :)

Można jeszcze kupić jednorazowe, plastikowe ezy w jałowym opakowaniu. Alternatywa dla drucika:-)

Samych szalek się nie strylizuje w autoklawie - szalki są zapakowane sterylnie, więc nie ma potrzeby, wystarczy wysterylizować samą pożywkę. No i autoklaw faktycznie można tu od biedy zastąpić piekarnikiem... Pożywkę dostaniesz zapewne w postaci proszku, który masz sam zalać wodą destylowaną - no i żeby rozpuścić agar, potrzeba wyższej temperatury, więc tak, czy inaczej konieczny piekarnik, ewentualnie mikrofalówka. Trzeba przy tym uważać, żeby mieszanka nie wykipiała na zewnątrz.

Szalki o ile nie są to plastikowe jednorazówki to będą używane wielokrotnie. Więc będzie się je sterylizować.

Poza tym proces wlewania sterylnej pożywki do sterylnych szalek, to kolejny moment kiedy pożywka będzie miała kontakt z zapylonym powietrzem.

Ja cały czas właśnie o jednorazówkach myślałem;-)

Pożywkę wylewamy na szalki pipetą - więc to samo co z wieczkiem - tylko lekko odchylamy folię przy ujściu kolby (lub innego naczynia, w którym mamy płynną jeszcze pożywkę), naciągamy pożywkę do pipety, przenosimy na szalkę lekko uchylając wieczko. Należy przy tym uważać, żeby niczego tą pipetą nie dotykać (stołu, zewnętrznych ścian naczynia, ubrań, skóry itd.).

Ja nie mam doswiadczenia w takich hodowlach grzybow a zwlaszcza w warunkach "domowych", ale z tego, co wiem, to w pewnej (tylko nie pamietam jakiej:-) odleglosci od płomiennia (jakiegos palnika np.) powietrze jest sterylne, wiec mozna spokojnie otwierac szalki ze sterylna pozywka, nalewac sterylna pozywke i nie martwic sie o zakazenie. Co do sterylizacji, to chyba nie tylko wysoka temperatura jest wazna, ale tez cisnienie. Wiem, ze przez jakis czas w jednym zakladzie na uniwersytecie u nas sterylizowali w szybkowarze - taki garnek ze szczelna pokrywka, w ktorym sie gotuje pod cisnieniem, wiec w domu spokojnie mozna go uzywac.

Z tym płomienniem, to nie chodzi zapewne o sterylność, bo już kilka, kilkanaście mm od od płomiennia temperatura jest zbliżona do pokojowej a ruch wstępujący powietrza wokół płomiennia sprawia. że czas oddziaływania temperatury na to co lata w powietrzu jest zbyt krótki aby wysterylizować powietrze, poza samym świecącym płomienniem i kilkoma mm wokoło.

Chodzi właśnie o ten ruch wstępujący ogrzanego powietrza. który zmniejsza szansę, że do otwartego pojemnika opadną zawiesiny unoszące się w powietrzu.

Z tego samego względu przy wysiewach nasion kaktusów metodą "sterylnych słoików" zaleca się wykonywać samo wsypywanie nasion przez krótkie otwarcie wieczka słoika nad miską z gorącą wodą. Wstępujący ruch ogrzanego powietrza ma zapobiec opadania zarodników grzybów pleśniowych do wysterylizowanego wnętrza słoika.

To w sumie taka domowa namiastka komory z laminarnym przepływem powietrza :)

Co do ciśnienia. To im wyższe ciśnienie tym wyższa temperatura wrzenia (w tym wypadku wody, pożywki). Można więc uzyskać wyższą temperaturę sterylizowanej ciekłej pożywki. Zarodniki szybciej giną w temp. >100stC niż w 100stC.

Konkretne przepisy ile minut sterylizować skutecznie w jakich warunkach, to trzeba by wyczytać w konkretnych procedurach z podręczników mikrobiologii.

Pimpek... Jak chcesz zobaczyc jak sie "to robi" to zapraszam do mnie do Katedry :) Powiem Ci wszystko od A do Z... Wyslij mi info na priv i zalatwione :)